Michaelis-Konstante - dies ist ein Indikator, der in der Biochemie und Pharmakologie verwendet wird, um die Aktivität von Enzymen zu bewerten. Die Bestimmung dieser Konstante ist ein wichtiger Schritt in der Untersuchung von enzymatischen Reaktionen und ermöglicht ein Verständnis dafür, wie diese Reaktionen ablaufen und reguliert werden.
Es gibt verschiedene Methoden und Techniken zur Bestimmung der Michaelis-Konstante. Die wichtigste davon ist grafische Konstruktionsmethode. Bei dieser Methode wird ein Diagramm erstellt, auf dem die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration verzögert wird. Aus dem resultierenden Diagramm wird dann der Schnittpunkt einer geraden Linie definiert, die den Ursprung und die ersten Punkte des Diagramms mit der Abszissenachse verbindet. Dabei ist der Wert der Michaelis-Konstante gleich dem umgekehrten Wert der Koordinate des Schnittpunkts entlang der Ordinatenachse.
Eine andere gebräuchliche Methode zur Bestimmung der Michaelis-Konstante ist Linearisierung. Bei dieser Methode wird das Michaelis-Menten-Gesetz so modifiziert, dass es möglich ist, eine direkte Abhängigkeit zu erhalten. Dann wird ein Diagramm erstellt, auf dem die Abhängigkeit der umgekehrten Reaktionsgeschwindigkeit von der umgekehrten Konzentration des Substrats verzögert wird. Dabei ist der Wert der Michaelis-Konstante gleich dem umgekehrten Wert des Neigungskoeffizienten der Geraden.
Bestimmung der Michaelis-Konstante: Die Methode des doppelten umgekehrten Graphen
Bei dieser Methode wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratniveaus bestimmt. Dazu werden mehrere Experimente durchgeführt, bei denen das Substrat in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wird. Dann wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei jeder Substratkonzentration gemessen.
Danach wird ein Diagramm erstellt, auf dem die Substratkonzentration entlang der Abszissenachse und die Reaktionsgeschwindigkeit entlang der Ordinatachse verschoben wird. Dann wird eine Annäherung der Diagrammdaten direkt durchgeführt. An dem Schnittpunkt dieser geraden Linie mit der Abszissenachse befindet sich der Wert der Michaelis-Konstante.
Als nächstes wird eine umgekehrte Umwandlung durchgeführt, und die reziprokalen Werte der Substratkonzentration werden auf das Diagramm aufgetragen. Es wird wieder eine direkte Verbindung zu den angenäherten Daten aufgebaut.
Am Schnittpunkt der zweiten Geraden mit der Abszissenachse befindet sich die gesuchte Michaelis-Konstante. Die Doppel-Reverse-Graph-Methode ermöglicht genauere Ergebnisse bei der Bestimmung der Michaelis-Konstante im Vergleich zu anderen Methoden.
| Substratkonzentration | Reaktionsgeschwindigkeit | 1/[Substrat] |
|---|---|---|
| 0,1 µm | 0,05mM/s | 10 |
| 0.2 µm | 0,1mM/s | 5 |
| 0,3 µm | 0.15mM/s | 3.333 |
| 0,4 µm | 0.2mM/s | 2.5 |
| 0,5 µm | 0.25mM/s | 2 |
Grafische Definition von KM durch Linuvayver-Berk
Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Reaktionsgeschwindigkeit (V) bei verschiedenen Substratkonzentrationen zu messen ([S]). Dies ermöglicht es, ein Diagramm der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (V-Graph) zu erstellen. Das Diagramm hat normalerweise eine hyperbolische Form, in der die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Substratkonzentration zunimmt, aber bei Erreichen einer bestimmten Konzentration sättigt.
Als nächstes wird eine lineare Annäherung des resultierenden Graphen durchgeführt, wobei die Abszisse auf der Achse 1 verschoben wird/[S] und auf der Ordinatachse - 1 / V. Auf der resultierenden linearen Abhängigkeit wird ein Diagramm (Linuwayver-Burke-Diagramm) erstellt, das geradlinig sein muss.
Der Schnittpunkt des resultierenden Linuwayver-Berk-Diagramms mit der Abszissenachse (bei der 1/[S]=0) entspricht der KM – Konstante von Michaelis. Auf diese Weise kann der KM-Wert grafisch ermittelt werden.
Die Linux-Berk-Methode ist recht einfach zu bedienen, erfordert jedoch bestimmte Berechnungen und Diagrammkonstruktionen. Es ist jedoch eine gute Alternative, KM zu bestimmen, wenn kein Zugang zu spezialisierter Hardware vorhanden ist.
Dixon-Methode
Das Prinzip der Dixon-Methode besteht darin, die Michaelis-Konstante anhand der Formel zu bestimmen:
1/𝑉_0 = 1/𝑉_max + 1/𝐾_m × (1/𝑆)
wobei 𝑉_0 die Reaktionsgeschwindigkeit bei einer bestimmten Substratkonzentration ist 𝑆,
𝑉_max - maximale Reaktionsgeschwindigkeit,
𝐾_m - Michaelis-Konstante,
Die Dixon-Methode beinhaltet eine Reihe von Experimenten, bei denen die Reaktionsgeschwindigkeit bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen und festen Werten anderer Reagenzien ermittelt wird. Die resultierenden Daten werden dann verwendet, um ein Diagramm zu erstellen, in dem die Reaktionsgeschwindigkeit in den Koordinaten 1/__0 und 1/𝑆 angezeigt wird. Die lineare Abhängigkeit im Diagramm ermöglicht es Ihnen, den Wert der Michaelis-Konstante zu bestimmen.
Die Dixon-Methode ist ziemlich genau und einfach auszuführen. Für seine Anwendung ist es jedoch notwendig, die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentrationen überwachen und messen zu können sowie mathematische Fähigkeiten zur Analyse der erhaltenen Daten zu besitzen.
| Vorteile der Dixon-Methode | Nachteile der Dixon-Methode |
|---|---|
| Einfache Ausführung | Die Notwendigkeit einer Reihe von Experimenten |
| Genauigkeit der Ergebnisse | Die Notwendigkeit, die Reaktionsgeschwindigkeit zu überwachen und zu messen |
| Möglichkeit zur Bestimmung der Michaelis-Konstante | Für die Datenanalyse sind mathematische Fähigkeiten erforderlich |
KM-Definition durch die Hortor-Methode
Eine Reihe von Reaktionen, bei denen die Substratkonzentration variiert, sind erforderlich, um KM mit der Hortor-Methode zu bestimmen. Die resultierenden Werte für die Reaktionsgeschwindigkeit und die entsprechenden Substratkonzentrationen werden dann verwendet, um ein Liniendiagramm zu erstellen. Das Hortordiagramm ist eine gerade Linie, wobei der KM-Wert dem negativen Wert des Winkelkoeffizienten dieser Linie entspricht.
Der Vorteil der Hortor-Methode ist ihre Einfachheit und relative Unabhängigkeit von verschiedenen Faktoren wie Temperatur und pH. Diese Methode hat jedoch auch Nachteile. Eine davon ist die Notwendigkeit, viele Reaktionen durchzuführen, um einen Hortor-Zeitplan zu erstellen, der viel Zeit und Ressourcen erfordert.
Insgesamt bleibt die Hortor-Methode ein wichtiges Instrument zur Bestimmung von KM in enzymatischen Reaktionen. Die Kombination aus Benutzerfreundlichkeit und hoher Genauigkeit macht es zu einer der bevorzugten Methoden für die Untersuchung der Kinetik von enzymatischen Prozessen.
Spektrophotometrische Definition der Michaelis-Konstante
Diese Methode basiert auf der Messung der Veränderung der optischen Dichte einer Enzymlösung in Gegenwart unterschiedlicher Substratkonzentrationen. Während der Reaktion wandelt das Enzym das Substrat in ein Produkt um, wobei sich die optische Dichte der Lösung ändert. Eine gewisse Zeit nach Beginn der Reaktion wird die optische Dichte mit einem Spektrophotometer gemessen.
Die spektrophotometrische Bestimmung der Michaelis-Konstante erfordert:
- Bereiten Sie eine Enzymlösung mit einer bekannten Konzentration vor.
- Bereiten Sie eine Lösung des Substrats mit unterschiedlichen Konzentrationen vor.
- Die optische Dichte des Substrat-Enzym-Reaktionsmischs für jede Konzentration messen.
- Zeichnen Sie ein Diagramm der Abhängigkeit der optischen Dichte von der Substratkonzentration.
- Bestimmen Sie aus dem Diagramm den Wert der Michaelis-Konstante.
Mit der spektrophotometrischen Methode können Sie genaue Daten über die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration erhalten, wodurch die Mikhaelis-Konstante und andere Parameter der enzymatischen Aktivität mit hoher Genauigkeit ermittelt werden können.
